Jason Bourne se cache et participe à des combats à mains nues, illégaux, pour assurer sa survie. De son côté, Nicky Parsons collabore avec le hacker et lanceur d'alerte Christian Dassault. À Reykjavik, en Islande, elle s'introduit dans les serveurs de la CIA et copie des fichiers sur les opérations noires de l'agence. Elle trouve également des documents sur le recrutement de Jason Bourne dans l'opération Treadstone et l'implication de Richard Webb, le père de Bourne. Son intrusion a cependant été détectée et des agents de la CIA implantent un logiciel espion dans une mémoire de masse qu'elle emporte. Ignorant la présence du logiciel, elle se rend en Grèce pour montrer à Bourne ses recherches, suivie à distance par Heather Lee, chef de la division sur le cyber-espionnage, qui rapporte ses allées et venues à Robert Dewey, directeur de la CIA.
En Grèce, Parsons et Bourne se rencontrent sur la place Syntagma, qui est le théâtre d'une violente manifestation surveillée par des policiers anti-émeute. Ils échappent à l'équipe envoyée pour les éliminer, mais Parsons est tuée par l'Atout (seul nom qui lui est donné pendant le film), un ancien tueur de la CIA sous les ordres de Dewey. Avant de mourir sous le coup d'une seconde balle, elle donne la clé d'une consigne où se trouvent les documents volés à la CIA. Résolu de trouver des réponses sur son passé, Bourne se rend à Berlin pour voir Dassault. Après que Dassault soit parvenu à déchiffrer les documents, Bourne découvre que son père, Richard Webb, a travaillé pour le compte de l'agence et est à l'origine de l'opération Treadstone. Entretemps, le logiciel espion informe Heather Lee de l'endroit où se trouve Bourne et Dewey dépêche une équipe pour le supprimer. Quelques instants plus tard, Lee détruit à distance les documents, puis informe Bourne qu'une équipe est en route, croyant que Bourne veut travailler à nouveau pour l'agence.
En se basant sur quelques indices, Bourne se rend à Londres pour retrouver Malcolm Smith, un ancien agent de surveillance ayant agi pour l'opération Treadstone. Lee défend son projet de « récupérer » Bourne auprès d'Edwin Russell, le directeur du renseignement national et supérieur de Dewey ; Russell acquiesce et Lee prend ses dispositions pour rencontrer Bourne. Dewey semble se plier à cette décision, mais ordonne en secret à l'Atout d'abattre l'équipe de Lee puis Bourne, parce qu'il ne partage pas les opinions de Lee. Se sachant sous surveillance, Bourne échappe à l'équipe de Lee et à l'Atout suffisamment longtemps pour confronter Smith. Ce dernier admet que Richard Webb a créé l'opération Treadstone mais s'est opposé au recrutement de Jason. Il affirme que Dewey a ordonné la mort de Richard, meurtre accompli par l'Atout, mais maquillé comme une attaque terroriste pour persuader Jason de joindre les rangs de la CIA. L'Atout tue Smith et blesse Jason, qui parvient à s'enfuir. Il prend contact avec Lee, qui lui déclare ne pas approuver les méthodes de Dewey ; elle lui donne rendez-vous à un congrès technologique à Las Vegas aux États-Unis.
Dewey se rend aussi au même congrès, pour participer à un débat sur le droit à la vie privée avec Aaron Kalloor, PDG de Deep Dream, société qui exploite un réseau social consulté par plus d'un milliard de personnes. Kalloor se présente comme le champion de la protection de la vie privée, mais tait sa collaboration secrète avec la CIA qui ambitionne d'utiliser le réseau de Deep Dream comme outil de surveillance de masse en temps réel, pour redonner vigueur aux opérations Treadstone, Blackbriar, Outcome et LARX. Soupçonnant que Kalloor refusera de poursuivre sa collaboration avec la CIA, Dewey ordonne à l'Atout d'abattre Kallor et Lee, cette dernière par manque de loyauté aveugle. Au congrès, Bourne contrecarre in extremis les meurtres, puis confronte Dewey dans sa suite. Le directeur de la CIA fait appel au sens du devoir et au patriotisme de Bourne dans le but de le retenir auprès de lui, sachant que des agents de la CIA se rapprochent, dont son bras droit Jeffers. Bourne tue ce dernier, puis Lee tue Dewey avant qu'il ne tire sur Bourne. Pour protéger Lee, il prend la responsabilité de la mort de Dewey. En quittant l'hôtel, il aperçoit l'Atout qui s'enfuit. Au terme d'une poursuite automobile dans Las Vegas et d'un corps à corps intense, Bourne tue l'Atout.
Quelque temps plus tard, Lee rencontre Edwin Russell et affirme pouvoir être ses oreilles et ses yeux dans l'agence. Elle a toujours le projet de ramener Bourne dans le giron de la CIA, mais accepte qu'il soit tué s'il ne veut pas revenir. Quelques minutes plus tard, Lee rejoint Bourne, promettant de changer la CIA pour le mieux. Bourne demande du temps pour réfléchir à sa proposition, mais en lui laissant dans sa voiture un enregistrement de sa conversation avec Russell, il montre qu'il n'a pas confiance en elle, puis il s'enfuit à nouveau.
Alors que Jason Bourne parvient à quitter Moscou, en Europe, un journaliste britannique, Simon Ross, apprend l'existence d'un programme inspiré de Treadstone, dont Bourne faisait partie : le programme Blackbriar. Lorsque la CIA en a connaissance, le chef des opérations du programme, Noah Vosen, entreprend de faire assassiner Ross, qui reçoit cependant l'aide de Jason Bourne, sans parvenir à échapper au tueur envoyé par Vosen. Bourne cherche alors à mettre fin aux exactions de la CIA tout en se rapprochant toujours plus de son passé, aidé en cela par Nicky Parsons, puis Pam Landy, manipulée par Vosen et le directeur de l'agence, Ezra Kramer.
Depuis deux ans Jason Bourne et son amie Marie Elena Kreutz vivent incognito à Goa en Inde. Bourne tente de retrouver la mémoire de son passé.
À Berlin, Pamela Landy, chef d'unité opérationnelle de la CIA monte une transaction qui doit lui permettre d'identifier une taupe responsable du détournement plusieurs années auparavant de 20 millions de dollars.
Kirill, un agent russe agissant pour le compte d'un magnat du pétrole, impliqué dans le détournement de fonds passé, torpille l'opération, s'empare de l'argent de la transaction et laisse sur place des indices incriminant Bourne. Kirill est ensuite envoyé à Goa pour éliminer Bourne et boucler ainsi l'opération d'intoxication. Repéré par Bourne, il abat Marie à sa place et laisse Jason pour mort. Ce dernier convaincu que la CIA est de nouveau sur ses traces entreprend de se venger, en revenant en Europe.
Dans le même temps, Landy enquêtant sur Bourne remonte la filière de l'opération Treadstone, programme secret de formation de tueur d'élite, auquel appartenait Bourne. Elle identifie les éléments essentiels de l'opération exposés dans la première partie de la trilogie (La Mémoire dans la peau) et établit un lien entre celle-ci, et la mort de Vladimir Neski quelques années auparavant en lien avec le détournement de fonds sur lequel elle enquête.
Bourne de son côté remonte la piste de Treadstone d'abord à Munich, où il contacte l'un des derniers membres vivant de l'opération, qui lui apprend que l'organisation a été démantelée. Il retrouve, à Berlin, Nicky Parsons, ex-responsable logistique de Treadstone à Paris, qui lui révèle l'identité du véritable père de Treadstone : Ward Abbott.
Bourne, toujours à la recherche des traces de son passé, retourne à l'hôtel Brecker ou il avait éliminé Neski et son épouse. Sur place il retrouve partiellement la mémoire sur ces évènements et échappe de justesse à une arrestation.
L'étau se resserre autour d'Abbott de plus en plus suspect aux yeux de Landy quant à son rôle exact. Il élimine son assistant qui a découvert une preuve de la machination contre Bourne. Bourne s'infiltre dans sa chambre d'hôtel et le confronte à son rôle exact dans l'affaire de détournement de fonds et l'assassinat de Neski. Avant de quitter Abbott, il lui révèle l'enregistrement de leur conversation et le laisse seul avec une arme. Abbott se suicide.
Bourne part pour Moscou. Il affronte Kirill dans une course poursuite spectaculaire, et l'élimine après avoir été blessé. Après avoir retrouvé la fille des Neski, il lui révèle que ses parents ne se sont pas suicidés comme le prétend la version officielle mais qu'il est responsable de leur exécution. Après une ellipse, qui constituera le début de La Vengeance dans la peau, Bourne se retrouve à New York et entre en contact avec Pam Landy, qui lui révèle son véritable nom. Il lui fait alors comprendre qu'il l'observe, puis quitte l'immeuble où il se trouve et se fond dans la foule.
Une nuit, dans les eaux de la Mer Méditerranée, non loin de Marseille, un chalutier italien repêche un homme inconscient, atteint de deux balles dans le dos. Soigné par l'un des membres du bateau, l'inconnu se remet de ses blessures, mais est totalement amnésique à la suite du choc. Le seul indice qui pourrait l'aider est une capsule implanté chirurgicalement au niveau de la hanche, munie d'un laser permettant de projeter un compte en banque d'une banque de Zurich. Lorsqu'il débarque à Zurich, il découvre des aptitudes au close combat et parle couramment l'allemand, lorsqu'il maîtrise deux policiers qui tentaient de l'arrêter, alors qu'il dormait sur un banc dans un parc fermé la nuit. Le lendemain, il se rend à la banque et trouve dans un coffre lui appartenant une importante quantité d'argent sous des devises différentes, une arme à feu et plusieurs passeports de différentes nationalites avec sa photo, dont une au nom de Jason Bourne, puis quitte les lieux et embarque dans un sac l'argent et les passeports.
Toutefois, un employé de la banque prévient un groupe de la division des activités spéciales de la CIA, Treadstone, au sujet de cette visite. Poursuivi par des policiers suisses, Bourne parvient à s'échapper et à se réfugier à l'ambassade des États-Unis, où il est accosté par des fonctionnaires venus l'arrêter, mais parvient à s'enfuir. Découvrant sur son passeport une adresse à Paris, il s'approche d'une jeune Allemande paumée, Marie Kreutz, que Bourne avait entraperçu dans l'ambassade, et lui demande de l'emmener à l'adresse du passeport contre 20 000 dollars.
Pendant ce temps, au siège de la CIA, le chef de l'opération Treadstone, Conklin, révèle à son supérieur, le directeur adjoint Ward Abbott, que Bourne était chargé d'éliminer un dictateur africain, Nykwana Wombosi, mais que la mission d'assassinat avait échoué. Dans l'intention de rompre tout lien entre l'agence et Wombosi, Conklin charge plusieurs tueurs hautement qualifiés pour éliminer Bourne.
Bourne, accompagné de Marie, débarque à Paris et se rend dans l'appartement. Il apprend qu'une de ses autres identités, John Michael Kane, aurait été tué deux semaines auparavant. Mais à peine arrivés, un premier tueur débarque dans l'appartement avant d'être mis KO par Bourne après un bref combat. Ce dernier demande à Marie de fouiller son sac dans lequel elle découvre, paniquée, des avis de recherches les concernant. Mais au moment où Bourne va la calmer, le tueur se relève et se défenestre sans avoir donné d'informations. Peu après, le couple quitte les lieux et commence une traque fomentée par Conklin.
Conklin mobilise une technicienne de la logistique dans un emplacement sécurisé de Treadstone à Paris, Nicolette Parsons, dans la recherche de Bourne et Marie, ce dernier voulant rencontrer Wombosi, après des recherches fructueuses concernant son passé, afin d'obtenir plus d'informations, mais l'ancien dictateur est abattu par le second tueur, le « Professeur ». Après la mort de Wombosi, Jason suppose qu'il était un assassin avant son amnésie et fuit avec la jeune femme, avec qui il a entamé une relation, dans la maison du beau-frère de cette dernière, où il décide de ne plus être ce qu'il était auparavant.
Dans le QG de la CIA, Conklin piste le couple jusqu'à la maison de campagne, où est envoyé, le lendemain matin, le « Professeur », pour les tuer, mais Bourne tente de créer une diversion et parvient à le blesser avec un fusil de chasse. Troublé par le dernier commentaire du mourant, il demande à Marie de fuir et utilise le téléphone portable du « Professeur », parvenant à contacter Conklin, afin d'organiser une réunion avec lui à Paris pour l'amener sur la place publique afin qu'il puisse retrouver sa trace.
Bourne suit Conklin jusqu'à à la maison sûre de Treadstone (il demande à Nicky de détruire toute preuve et de fermer les lieux), où il s'introduit et met en joue ce dernier, qui lui annonce que Bourne avait tout planifié pour l'exécution de Wombosi, ce qui réveille des souvenirs dans sa mémoire : Il utilisait le pseudonyme de Kane pour infiltrer l'entourage de Wombosi, mais ne pouvait se résoudre à le tuer parce que les enfants de ce dernier étaient présents. Quand il a interrompu la mission et a essayé de fuir, il fut touché par deux balles et tomba par-dessus bord du yacht de Wombosi dans la Méditerranée avant d'être repêché par les pêcheurs italiens.
Après avoir annoncé à Conklin son intention de quitter Treadstone et son avertissement s'il est suivi, Bourne s'engage dans une fusillade avec plusieurs assassins, qu'il parvient à tous abattre et s'enfuit des lieux. Peu après, Conklin est assassiné par un troisième tueur, chargé initialement de la traque de Bourne, sur les ordres d'Abbott, qui explique quelque temps après les événements, que l'arrêt de l'opération est due à son ratio avantages-coûts inefficace et propose un nouveau programme, Blackbriar.
Maintenant libre, Bourne rejoint Marie à Mykonos, où elle a ouvert une boutique de location de scooters avec l'argent qu'il lui avait donné et ils partagent une étreinte amoureuse.